Test in vitro: premiata ricerca italiana

Team Lab
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Indagare la potenza delle sostanze nell’indurre una reazione allergica da contatto con metodi in vitro: dall’Università di Milano un progetto di ricerca che riceve il Lush Prize
Il superamento del ricorso ai test su animali per valutare il profilo tossicologico delle sostanze rappresenta un obiettivo cruciale per il settore cosmetico. Tra gli endpoint critici, la sensibilizzazione cutanea, pur con notevoli passi avanti, ancora non risulta completamente indagabile con metodi alternativi. Un ulteriore contributo in quest’area arriverà dal Laboratorio di Tossicologia presso il Dipartimento di Scienze Farmacologiche dell’Università degli Studi di Milano, grazie a un progetto di ricerca finanziato dal Lush Prize che, nella sezione Giovani Ricercatori 2015, ha premiato la venticinquenne Elena Kummer, neolaureata in Farmacia, che in questo Laboratorio intende proseguire la propria attività di ricerca sui metodi in vitro.
Il premio, fondato e promosso dalla marca cosmetica inglese e da Ethical Consumer Research Association, finanzia ogni anno progetti scientifici, di formazione e di comunicazione finalizzati allo sviluppo dei test alternativi e all’abbandono della sperimentazione su animali.

Quali sono gli scopi e il disegno del progetto di ricerca?
L’obiettivo ultimo è mettere a punto metodi in vitro che, utilizzando linee cellulari umane, possano identificare il potenziale allergenico e la potenza di sostanze destinate a uso topico. Il nostro progetto si focalizza in particolare sullo studio del ruolo della protein-chinasi C (PKC), un enzima coinvolto nell’attivazione cellulare nella dermatite allergica da contatto. Precedenti studi svolti da questo Laboratorio hanno evidenziato che questa proteina viene attivata durante il processo di differenziazione delle cellule dendritiche in seguito allo stimolo da parte di un allergene. L’attivazione di PKCβII nelle cellule dendritiche è associata a una induzione di alcuni marker, come CD86, indispensabile per la stimolazione delle cellule T e attivazione della risposta immunitaria. Scopo dello studio è correlare la potenza di un certo allergene con il grado di attivazione della PKC e la produzione di molecole di co-stimolazione e citochine nelle cellule dendritiche. Prenderemo quindi in considerazione diversi allergeni e ci aspettiamo di riscontrare un diverso grado di attivazione e maturazione delle cellule in funzione del grado di potenza dell’allergene.

Quali allergeni utilizzerete?
Tre allergeni da contatto noti per il loro diverso grado di potenza: il benzochinone, un allergene forte, il dietilmaleato, che è di media potenza, e la penicillina G, debole. La linea cellulare che useremo sarà la THP-1, cellule promielocitiche umane come surrogati delle cellule dendritiche. In seguito all’esposizione di queste cellule ai diversi allergeni, andremo a misurare la loro attivazione, per definire una scala di induzione in relazione alla potenza dell’allergene. Se l’ipotesi di lavoro risultasse verificata, si potrà ampliare a sostanze di potenza ignota.

Elena Kummer
Elena Kummer

Quali sono gli aspetti innovativi di questa ricerca rispetto alle attuali conoscenze?
I metodi alternativi finora sviluppati permettono di comprendere se una sostanza sia un allergene o no, ma nessuno è in grado di predirne la potenza. La potenza di un allergene, e quindi la dose necessaria per attivare una risposta immunitaria, al momento è valutabile solo in vivo, quindi su modelli animali, quale il test del linfonodo locale (LLNA). L’aspetto innovativo riguarda il correlare il grado di attivazione in vitro delle cellule dendritiche con la potenza in vivo dell’allergene e identificare la dose minima necessaria per innescare il processo. Questo è fondamentale per contribuire all’obiettivo di abbandonare l’utilizzo degli animali per la valutazione del rischio di sensibilizzazione cutanea: dare informazioni quantitative sulla potenza dell’allergene utilizzabili ai fini della caratterizzazione del rischio.

Dove vi aspettate di arrivare con questo studio grazie al finanziamento del Lush Prize?
Il premio ci permetterà di finanziare la fase iniziale di fattibilità dello studio e di verificare la possibilità, attraverso successive ricerche che necessiteranno di ulteriori finanziamenti, di sviluppare un test che possa essere integrato nell’ambito delle strategie di valutazione alternative oggi esistenti, evitando il ricorso all’uso degli animali.

C’è un contributo diretto delle imprese alla vostra ricerca?
Raramente le aziende erogano contributi alla ricerca di base. Normalmente finanziano studi applicativi collegati allo sviluppo dei propri prodotti. I fondi pubblici per la ricerca in Italia sono scarsi, in laboratorio lo avvertiamo nella vita di tutti i giorni. Forse un maggior interscambio tra l’università e l’impresa permetterebbe una attenzione dell’industria a sostenere la ricerca, almeno laddove costruisce strumenti indispensabili per l’industria stessa.

Che progetti ha per il suo futuro?
Al momento vorrei proseguire nella ricerca. Questo premio mi permetterà di intraprendere per un anno questo studio; inoltre, nei miei progetti ci sarebbe il concorrere a un posto di dottorato per continuare a lavorare in questo laboratorio. Non mi dispiacerebbe in futuro lavorare in un ruolo di raccordo tra il mondo della ricerca universitaria e l’impresa. Al momento comunque non mi sento di escludere alcuna possibilità, anche perché mi sento personalmente aperta a esperienze differenti, nell’università o anche nell’industria.

 

SENSIBILIZZAZIONE CUTANEA: COSA MANCA A UNA COMPLETA SOSTITUZIONE?
Il commento di Emanuela Corsini, professore associato membro del Laboratorio di Tossicologia presso il Dipartimento di Scienze Farmacologiche e Biomolecolari dell’Università degli Studi di Milano

A quando una completa sostituzione?
Siamo sulla buona strada. Al momento, integrando tutte le informazioni derivanti dagli approcci in vitro, in silico e in chemico, arriviamo a una risposta sì/no e a una stima della categoria (forte, moderato o debole allergene e sicuramente 1A o 1B per la classificazione GHS), sufficiente per un’identificazione del pericolo e per una corretta etichettatura ai fini del CLP, ma non per la caratterizzazione del rischio. Infatti non è possibile ancora, con metodi animal free, l’individuazione della dose di non induzione, parametro necessario per una valutazione del rischio di sensibilizzazione. La ricerca internazionale si sta concentrando sullo sviluppo di metodi per stabilire la dose minima di induzione, aspetto che risente della mancanza di conoscenze sufficienti sui meccanismi che fanno di una sostanza un allergene più o meno potente. Il progetto di ricerca finanziato dal Premio Lush rientra proprio in questo filone. Nel settore cosmetico, in cui i test su animali sono vietati, in alcuni casi le aziende, integrando i riscontri dagli approcci alternativi, identificano la classe di potenza di una certa sostanza e traggono informazioni indicative circa la dose di non induzione riferendosi alla scala di reattività del test LLNA, formulando poi secondo dosaggi opportunamente inferiori.

Quale evoluzione si attende dal punto di vista regolatorio?
L’aspetto interessante che è emerso dalla correlazione tra i dati in vivo con quelli ottenuti con i metodi in vitro è che questi ultimi, che si basano su linee cellulari umane o su surrogati di tessuti, predicono molto meglio il dato riferito all’uomo rispetto ai test sull’animale. La complessità dei meccanismi che portano all’induzione del fenomeno allergico obbliga ad adottare un approccio che integri diversi dati. L’accettazione da parte delle autorità regolatorie di queste strategie integrate e della conseguente classificazione (sì/no e per classi di potenza) è ancora attesa: finora c’è stata una comprensibile prudenza nell’adozione degli approcci alternativi, tuttavia credo che sia il momento di riconoscere la qualità e predittività dei metodi non animali, non solo per il settore cosmetico ma anche ai fini del REACH. Uno studio sulle sostanze a oggi registrate all’ECHA ha evidenziato che circa il 30% di esse si dimostrano allergeni da contatto. Se la classificazione fino alla classe di potenza venisse accettata, si potrebbe limitare l’uso del test su animale per la caratterizzazione della dose minima di induzione alle sole sostanze che, tra queste, sono destinate a usi che espongano per esempio al contatto con la cute, con una significativa riduzione del ricorso ai test su animali. D’altra parte le autorità regolatorie stanno lavorando a una linea guida ufficiale, di cui si attende la pubblicazione, su come integrare le informazioni dagli approcci alternativi, che includono metodi già validati, metodi in via di convalida e altri scientificamente validi. Seppur da applicare con l’indispensabile flessibilità, un riferimento ufficiale è oggi urgente.

 

di E.Perani